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2018/06/25

ヒト大脳オルガノイドの培養で確認すべきポイント「STEMdiff Cerebral Organoid」

用途別細胞培養

「オルガノイド研究ハンドブック」では、腸管・脳・膵臓・肝臓・腎臓・肺オルガノイドの培養プロトコル、アプリケーション、文献、FAQなどを紹介しています。

ヒト多能性幹細胞（ヒトES/iPS細胞、hPSCs）由来の2次元（2D）神経培養系は神経研究に有用なモデルです。しかし、後生動物（metazoan、多細胞動物）の大脳の複雑な組織化構造を再現するには限界があります。

一方、大脳オルガノイドの3次元（3D）培養システムはヒト脳組織の発生を再現可能で、ヒト特有の神経学的発達や疾患プロセスの研究のために生理学的関連性の高いin vitroモデルをもたらします。たとえば、ジカウイルス感染によって引き起こされる疾患（小頭症）、統合失調症（ASD）などのヒト脳発達および脳・神経学的障害の研究に重要なツールとなります。

本稿では、「STEMdiff Cerebral Organoid Kit」を用いたヒト大脳オルガノイド培養において、各過程で確認すべき重要なポイントを紹介します。

STEMdiff Cerebral Organoid Kitの概要
STEMdiff Cerebral Organoid Kitのプロトコール　詳細
動画マニュアル
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STEMdiff Cerebral Organoid Kitの概要

Dr. Madeline Lancasterのプロトコールで培養した大脳オルガノイドは、7層構造を示すことが報告されています。「STEMdiff Cerebral Organoid Kit」はDr. Lancasterが発表した成分に基づいて開発され、大脳オルガノイド形成効率をより高めるよう最適化した培養システムおよび簡便なプロトコールを提供します。無血清で、all-in-oneの「STEMdiff Cerebral Organoid Kit」を使用することで、ヒト多能性幹細胞（ヒトES/iPS細胞、hPSC）からの脳オルガノイドの形成効率と再現性を高めることができます。

Dr. Madeline Lancasterのインタビュー記事（STEMCELL Technologies社のウェブサイト）

STEMdiff Cerebral Organoid Kit 操作プロトコール

大脳オルガノイドの培養プロトコール　概要

STEMdiff Cerebral Organoid Kitによる大脳オルガノイド培養は、胚葉体（EB）形成、神経誘導、増殖、成熟という4つの簡便なステップでおこないます。最短40日で成熟した大脳オルガノイドが得られます。

STEMdiff Cerebral Organoid Kitのプロトコール　詳細

STEMdiff Cerebral Organoid Kitによる大脳オルガノイド培養の方法と注意点を、プロトコールの段階ごとに紹介します。

1. EB 形成段階（0～5日）のプロトコール

EB形成段階（0～5日）の形態

EB 形成（0～5日）での注意点

Day 5（EB形態確認）： EB形態の確認→丸く滑らかなエッジ
直径：300 μm以上 (典型的な直径は400 - 600 μm)

2. 神経誘導段階（5～7日）のプロトコール

神経誘導段階（5～7日）の形態

神経誘導段階（5～7日）での注意点

Day 7（EBの形態確認）：神経化したEBの形態確認→光学的に半透明で滑らかなエッジ。マーカー発現：PAX6、ZO-1。

3. 増殖段階（7～10日）のプロトコール

増殖段階（7～10日）でMatrigelに埋める方法

増殖段階（7～10日）での注意点

MatrigelにEBを埋める方法：滅菌したParafilm上でEBをMatrigelに埋め、～30分、37℃でインキュベートする（Matrigelを30分以上インキュベートしないこと）
MatrigelにEBを埋めるときは、慎重にEBの培地（5 μL培地/50 μL Matrigel程度）を除去しておく（除去しないとEBが大きくなる可能性がある）